3.3. 糖苷聚糖和蛋白质结晶#
案例来自论文: “糖基化试剂对硫酸铵结晶蛋白质的影响”
Crystal Growth & Design: Influence of Glycan Agents on Protein Crystallization with Ammonium Sulfate
该论文围绕蛋白质与聚糖的相互作用机制展开，通过分子动力学（MD）模拟及相关分析方法，揭示了聚糖添加剂对蛋白质结晶的影响。
使用工具: #Amber
3.3.1. 模型构建#
(1). 使用了两种糖苷聚糖 (glycan) 作为结晶添加剂:
海藻糖（Trehalose）
Facade ®-TEG: 3α,7α,12α- 三 [(O-β-D - 吡喃葡萄糖基)乙氧基]- 胆烷
图. 3.3.1 两种聚糖分子的化学结构式#
(2). 选择了两种蛋白质, 硫酸铵（AS）作为沉淀剂进行结晶, 蛋白质结构来自 X-射线晶体解析, PDB数据库.
流感病毒聚合酶酸性亚基 N 端结构域（PAN）: PDB ID 为 7XGC
壳聚糖酶: PDB ID 为 7XGQ
(3). 模拟盒子构建
在PAN模型中加入 1 个海藻糖分子
在壳聚糖酶模型中加入 1 个 Facade ®-TEG 分子
为保证采样充分，每种蛋白质构建 8 个独立模型，每个模型中 glycan 分子在蛋白质周围溶剂区随机分布于 8 个不同位置。
最后构建不含 glycan 分子的空白对照模型（PAN和壳聚糖酶各 1 个），用于对比分析。
(4). 溶剂与边界条件: 将蛋白质-glycan 复合物置于长方体周期性边界盒中, 使用 TIP3P 水分子填充盒子, 确保蛋白质到盒边界的最小距离为 20Å；加入抗衡离子（如 Na⁺、Cl⁻）中和系统电荷。
3.3.2. 力场与模拟参数#
力场选择：蛋白质采用 ff14SB 力场，海藻糖和 Facade ®-TEG 采用 GAFF2（General Amber Force Field 2）力场。
电荷计算：通过 Gaussian16 程序计算 glycan 分子的原子电荷 —— 先在 B3LYP/6-31G** 水平下进行几何优化，再用 IEFPCM 方法（溶剂为乙醚，介电常数 ε=4）计算静电势，最后通过 RESP 方法确定原子电荷。
非共价相互作用：非共价相互作用（范德华力、静电力）的截断距离设为 12Å。
3.3.3. 执行 MD#
在有无聚糖存在情况下, 进行了的多次分子动力学（MD）模拟。
按照分子模拟的标准流程，依次进行能量最小化、加热、平衡化和生产模拟：
能量最小化：
第一步：仅优化水分子和抗衡离子，消除局部不合理相互作用；
第二步：优化系统中所有原子，确保整体结构稳定。
NVT平衡：在 NVT 系综（恒容、恒温）下，将系统从低温加热至 300K，时长 100ps，使系统温度达到模拟目标温度。
NPT平衡：在 NPT 系综（恒压、恒温）下进行 400ps 平衡，调整系统体积和压力至稳定状态（压力维持在 1atm）。
生产模拟：在 NPT 系综下, 每个盒子进行 1μs 生产模拟，时间步长 2fs，记录轨迹用于后续分析。
3.3.4. 结果分析#
通过多种分析方法解析蛋白质与 glycan 的相互作用及系统动态特性：
(1). 结构稳定性评估：
均方根偏差（RMSD）：计算主链原子（N、Cα、C）的 RMSD，结果显示含 glycan 的模型 RMSD 波动更小（如PAN的 RMSD 多在 1-2Å），表明 glycan 增强了蛋白质结构稳定性。
回转半径（Rg）：评估蛋白质构象紧凑性，含 glycan 的复合物Rg值更稳定（如PAN的平均Rg为 16.36±0.09Å），提示构象更紧凑。
(2). 原子动态波动分析（B-factor）：计算蛋白质主链原子的 B 因子（温度因子, 反映原子热振动），发现 glycan 结合区域的 B 因子低于无 glycan 模型，表明 glycan 降低了结合位点的局部柔性，增强构象刚性。
B 因子（B-factor）又称温度因子，用于量化原子在晶体结构中的位置不确定性，主要来源于原子的热振动和静态无序。一般来说，B 因子值越高，表明该区域原子的波动越大、柔性越强；B 因子值越低，则意味着该区域构象更刚性、稳定性更高。在分子动力学模拟中，B 因子可通过轨迹计算获得，用于反映模拟过程中原子的动态波动特性。
图. 3.3.2 两种蛋白质的 B 因子(橙色线条为不含聚糖) 及蛋白质上标记出的波动幅度#
(3). 构象动态分析（主成分分析，Principal Component Analysis, PCA）：对模拟轨迹进行 PCA，结果显示含 glycan 的复合物构象分布更集中（聚类更紧凑），提示 glycan 限制了蛋白质的大范围运动，促进构象稳定。
PCA 通过对原子坐标的协方差矩阵进行特征分解，将蛋白质的复杂运动分解为少数几个主成分（PC），每个主成分代表一种独立的集体运动模式。其中，前两个主成分（PC1 和 PC2）通常贡献最大，可通过二维投影图展示蛋白质构象的分布范围和动态变化趋势。
图. 3.3.3 两种蛋白质主成分分析（PCA）的二维投影#
(4). 结合自由能计算（MM-PBSA 方法）：通过公式 \(ΔG_{bind}=ΔE_{vdW}+ΔE_{Ele}−TΔS+(ΔG_{pb}+ΔG_{SA})\) 计算结合能，通过能量分解发现疏水相互作用（范德华力ΔEvdW）是复合物稳定的主要驱动力（如壳聚糖酶 - Facade ®-TEG 复合物的ΔEvdW贡献显著）。
(5). 静电势与结合位点分析：
静电势计算：用 Delphi 程序计算蛋白质表面静电势，发现多数 glycan 结合位点位于正负电势边界区域（电势绝对值低），与晶体中蛋白质-蛋白质接触区重合。
结合位点预测：通过 Hydrophobe 程序预测疏水位点，验证了 glycan 结合位点的合理性（如PAN的结合位点位于 α 螺旋与 β 折叠的间隙）。
图. 3.3.4 两种蛋白质的表面静电势等值面及其与相应聚糖分子的位置关系#
综上，文中的分子模拟通过系统的模型构建、严格的参数控制和多维度的结果分析，揭示了 glycan 分子通过稳定蛋白质构象、增强刚性及特异性结合，促进蛋白质结晶的分子机制。